喷雾干燥对干扰素α-2b稳定性的影响

随着生物技术的日趋成熟，越来越多的蛋白和肽类药物投人市场，然而当前单调的剂型注射剂及其低温储存条件在很大程度上限制了该类药物的使用。研究与开发一种使用方便、常温存放的新剂型将为蛋白类药物的市场打开一个新局面。由于这种高活性药物的稳定性与普通的化学药相比脆弱得多，因而其稳定性一直是一个令人关注的问题。
干扰素a-2b虽然早有注射剂（包括冻干粉针）上市，但是其以注射给药及大多需要加人人血白蛋白为稳定剂的缺点却是显著的。本实验以干扰素a-2b为模型药，研究了喷雾干燥条件和非人血成分的活性保护剂对其稳定性的影响，以期为这种蛋白质药物的非注射途径给药干粉吸人剂的开发作准备。
1仪器与试药干扰素a-2b原料（天津华立达生物工程公司）；大豆卵磷脂（北京双旋微生物培养基制品厂）；L-赖氨酸（天津市东方卫生材料厂）；十二烷基硫酸钠（天津市博迪化工有限公司）；羟丙基甲基纤维素（山东肥城瑞泰精细化工有限公司）；羟丙基卩-环糊精（西安德立生物化工有限公司）；其他试剂均为分析纯。
2实验方法2.1喷雾干燥配制好缓冲溶液后，加人赋形剂并振摇使之溶解，如有必要再加入添加剂使之分散成溶液或混悬液。加人干扰素a-2b溶液，混合均匀，放置约15min后即可进行喷雾干燥。喷雾干燥热风风量调至仪器满程的90，喷液速度为3mLmin-1，待喷雾结束后，调低进口温度并维持出口温度（70±5）大约20min以进一步降低产品的含水量。
2.2干扰素a-2b活性的测定用细胞病变抑制法测定干扰素a-2b的抗病毒活性。具体操作如下：将选用的肿瘤细胞稀释、并种/荦昶钿拿家于96孔板，置37尤二氧化碳培养箱培养约6h，使细胞贴附于板上；稀释好标准品和样品，加人细胞中，培养24h，使干扰素a-2b作用于细胞以提高其免疫力；加入病毒，培养大约12h，攻击细胞；染色，洗脱；用酶标仪测定吸光度，并根据标准品计算出样品的效价及活性保留率。
2.3差热扫描量热法物理混合物的制备：按喷雾干燥比例称取赋形剂、添加剂和缓冲盐适量，置研钵中研磨均，喷入少量干扰素a-2b原液，室温放置干燥，再研磨均匀，样品置干燥器中待测。DSC测定条件：称取混合物或喷雾干燥产品5~7mg，在30~ 250丈范围内扫描，升温速度为lOTnin-1. 3结果与讨论3.1喷雾条件的影响3.1.1雾化的影响蛋白质在雾化过程中受到机械剪切力以及界面聚合等因素的作用，其活性有可能受到影响。空气的非极性性质导致了空气/液体界面的疏水性，这就使得蛋白质在喷雾干燥过程中很有可能因界面聚集而失活。11等研究发现雾化气体流量/饲液速度的比值对蛋白质的稳定性有着显著影响。我们对雾化风量进行了研究，进口温度为室温，将干扰素a-2b稀释于PH=7.04的缓冲体系后，用下述雾化气体流速分别进行喷雾：500，550，600，650，700，750，800111-1，所得溶液收集后存于4T待测定。结果见。
雾化气体流速/bh-1雾化空气流速对干扰素a-2b稳定性的影响。n由知，雾化空气的流速越大，干扰素a-2b失活程度越高。这可能是因为高流速的空气雾化效果越好，雾化液滴越小，一方面导致更大的气/液界面，增加了干扰素a-2b界面聚集的可能性；另一方面高流速的空气产生更高的剪切力，也有可能直接破坏干扰素a-2b的立体结构。
3.1.2温度的影响蛋白质的热稳定性较差，然而在喷雾干燥过程中雾化液滴的温度远远低于热风的进口温度，而与其出口温度更为接近，加之喷雾干燥过程中雾滴是瞬间干燥，一般仅为几秒钟，因而蛋白质经历喷雾干燥其活性有可能得到较高程度的保留。为了考察喷雾干燥温度对亍扰素a-21）活性的影响，将干扰素a2b加至以乳糖为赋形剂、pH值7.02的缓冲溶液中，混后平均分成9份，分别在热风进口温度为100，105，110，115，120，125，130，135，1401条件下喷雾干燥。结果见。
进口度/t：喷雾干燥过程中热风进口温度对干扰素a-2b活性的影响。n=5由可知，干扰素a-2b的稳定性受温度的影响很大，温度越高，干扰素a-2b的活性丧失越严重。进口温度在U0T附近（出口温度大约为74），喷雾干燥后干扰素a-2b的活性基本保持在70左右，但是当温度升高至140（出口温度大约为107T）后，则仅仅有大约30的干扰素a-2b还有活性。考虑到喷雾干燥的可操作性和干扰素-2b的稳定性，我们选定热风的进口温度在110. 3.1.3雾化气体的影响以HPCD为保护剂、乳糖为赋形剂、枸橼酸-磷酸氢二钠为缓冲体系（pH=7.02），考察雾化气体对干扰素a-2b在喷雾干燥过程中活性的影响，用高纯氮气替代普通的压缩空气，流速设定为575IrtT1，进n温度110T.结果发现干扰素a-2b的活性保留由原来的84提高至117，表明高纯氮气比普通的空气更有利于干扰素a-2b的稳定。但是考虑到用气量较大，而高纯氮气价格也不低，除非特别注明，通常我们在研究中均采用普通的压缩空气为雾化气体。氮气比空气具有更好的效果，其原因尚待进一步研究。有可能是雾化效果的不同，也有可能是氮气与空气在性质（比如极性、氧化性、含水量）上的差异所致。
3.2pH值、缓冲体系的影响3.2.1溶液pH对活性的影响以枸橼酸-磷酸氢二钠为缓冲体系，分别调节溶液pH值至8.15，7.06，6.50，5.52，5.03，4.27，3.69，加人适当赋形剂和干扰素a-2b，同一喷雾条件下干燥后测定干扰素a-2b活乳糖为赋形剂的处方所得到的产品的活性低。为了考察其原因，我们进行了多方面的设想和实验。偶然地，对比产品的DSC图，发现了较大的差别，见图性，结果见表1D表1缓冲体系pH值对干扰素a-2b活性的影响。n=5，pH值活性保留/pH值由表1可知，干扰素a-2b在碱性条件下不稳定，当PH =8.15时，活性仅保留24；在其等电点（PI =5.9）附近稳定性也较差，可能是因为在等电点附近，蛋白质不带电荷或所带电荷较少，分子间相互排斥力减弱，致使蛋白质颗粒聚集、沉淀；中性和酸性条件下干扰素a-2b的稳定性都是较好的，不过酸性对机体的刺激性比较强烈，因而不宜采用。进一步的考察表明。特别是中性条件附近（pH值在6.6~7.1之间），干扰素a-2b的稳定性更好一些，加之这个范围的pH值对机体不会产生较大的刺激性，因而pH值在6.67.1是较好的选择。
3.2.2不同缓冲体系对活性的影响分别考察了下列缓冲体系对干扰素a-2b活性的影响：缓冲盐体系为枸橼酸-枸橼酸钠（缓1）、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠（缓2）、枸橼酸-磷酸氢二钠（缓3）、磷酸二氢钠-枸橼酸钠（缓4）、抗坏血酸-抗坏血酸钠（缓5），调节缓冲体系的pH值为7.0左右，加人适当赋形剂和干扰素a-2b，喷雾干燥后测定干扰素a-2b活性，结果见表2.表2不同缓冲体系对干扰素a-2b活性的影响。=缓冲体系活性保留/缓冲体系活性保留/缓1缓4缓2缓5缓3上述结果表明，含有枸橼酸的缓冲体系对干扰素a-2b的稳定性比较有利，特别是枸橼酸-磷酸氢3.3赋形剂的影响千扰素a-2b作为一种高活性蛋白（比活性高达1.6xlOSmg-1），实际使用中多加人一定量赋形剂以起到赋形和稀释的作用。赋形剂的选择对蛋白质的稳定性也可能产生影响，分别以乳糖和甘露醇为赋形剂，考察其对干扰素a-2b稳定性的影响。结果表明，即使是在喷雾条件、所加保护剂完全一致的情况下，几乎所有以甘露醇为赋形剂的处方都比以度/t含甘露醇的处方在喷雾干燥前（A）与干燥后（B）的DSC图对比上图可知，含乳糖的处方在干燥后基本为无定形状态，而含甘露醇的处方在喷雾干燥后仍然保留结晶态，这与我们通常认为喷雾干燥产品为无定形的观念有些相悖。甘露醇在喷雾干燥过程中的结晶过程有可能可用来解释它对干扰素a-2b活性的损害作用，因为喷雾干燥是一个瞬时干燥过程，甘露醇分子在几秒钟内迅速迁移结晶，导致干扰素a- 2b经受剧烈的紊乱或剪切，从而破坏其天然构象。
乳糖在喷雾干燥过程中并不结晶，乳糖分子还有可能支撑干扰素a-2b的空间结构，从而达到稳定效果。
3.4保护剂的影响糖类、氨基酸等小分子有可能替换喷雾干燥过程中的水分子而支撑蛋白质的空间构象，从而起到维持蛋白活性的作用；高分子凭借自身的立体构型也有可能“固定”蛋白的构象或者凭借其较高的黏度防止蛋白质相互靠近形成多聚体而失活；蛋白质作为一种表面活性物质，在雾化过程中很有可能迁移至液滴外层的气液界面聚集，加人表面活性剂则有可能与蛋白质在液滴表面竞争吸附从而减少蛋白质的界面吸附。基于上述考虑，我们考察了糖类、氨基酸、高分子和较强的表面活性物质对干扰素a-中药粉气悬浮臭氧逆流接触灭菌方法的研究宋丽丽1，范丙义1，谷传动2，卢鹏伟1，何颖1，张启明1，张iWd.河南大学，河南开封475001；2.中仁工贸有限公W，河南郑州450047）黄丸等制剂的混合药粉进行灭菌处理，进行灭菌效果观察及工艺条件筛选；选择山莱萸等六味药材的原生药粉，进行流通蒸汽灭菌、干热灭菌、Co辐射灭菌和臭氧灭菌的比较研究，在统计比较样品灭菌效率的同时，分别对其灭菌前后的X射线衍射光谱（XRD）和红外光谱（IR）进行聚类分析，以探讨化学成分的变异，并对样品中目标成分丹皮酚、熊果酸的含量损失率进行对比分析。结果臭氧灭菌法对样品的灭菌率平均为95.24，比干热灭菌法高6.81，稍低于WG>辐照灭菌法和流通蒸汽灭菌法；对样品化学成分的影响较小，其优越性高于流通蒸汽灭菌法和干热灭菌法。结论臭氧技术用于中药粉的灭菌效果稳定，对成分损坏较小，可在常温常压条件下同上下游工序联动操作，是中药大生产中对入药生药原粉在线灭菌的优良方法。
2b在干燥过程中的稳定作用，具有稳定效果的保护剂，见表3.表3稳定剂对干扰素a-2b在喷雾干燥过程中的稳定作用。
灯=5，无士s活性保护剂活性保留/活性保护剂活性保留/羟内基环糊精十二烷基硫酸钠赖氨酸羟丙基甲基纤维素卵磷酯聚山梨酯20由表3可知，表面活性物质如十二烷基硫酸钠、羟丙基甲基纤维素、卵磷脂和聚山梨酯20对干扰素a-2b在喷雾干燥过程中均具有较强的保护作用，而赖氨酸和羟丙基-P环糊精也表现出较强的稳定作用。
4结语通过本研究发现，通过采用适宜的工艺和调整处方后干扰素在喷雾干燥过程中的稳定性可以大大提高。该研究中，对干扰素稳定性的影响主要因素除温度、pH值和缓冲体系外，赋形剂和活性保护剂的作用尤其值得注意。喷雾干燥过程中的机械剪切力和界面聚合在蛋白质的失活过程中有着重要影响，但是这两种失活机制都可以借助制剂因素加以调整。基于对干扰素的考察，期望能为该类药物制剂的进一步研究打下基础，并为其他蛋A类药物的开发提供。