原发性干燥综合征唇腺组织中细胞凋亡及相关基因表达的研究

原发性干燥综合征唇腺组织中细胞凋亡及相关基因表达的研究汤艳春王吉波孙雪辉王少坤袁威玲定位。结果pSS患者唇腺组织中腺泡上皮细胞（AEC）及导管上皮细胞（DEC）凋亡率均明显高于对照组（！<0.001），而浸润的单核细胞（IMC）凋亡率与对照组相比差异无显著性（！>0.05）。pSS患者唇腺AEC、DEC及IMC中，Fa>阳性表达的细胞百分比均明显高于对照组（！<0.001），并与细胞凋亡率呈正相关率呈正相关（\"=0.654，0.619，0.489；！<0.01）；Bc1-2阳性表达的细胞百分比，AEC和DEC均明显低于对照组（！<0.05），而IMC明显高于对照组（！<0.001），DEC和IMC与细胞凋亡率呈负相关（\"=-0.400，-0.364；！<0.05），但AEC与细胞凋亡率无相关性（\"=-0.329，0.05）。结论pSS患者唇腺组织中上皮细胞凋亡增加和淋巴细胞凋亡减少可能是导致腺体破坏进而功能丧失的原因之一；Fa>、Fa>L增加及Bcl-2减少皆与促进细胞凋亡有关；Bcl-2在pSS唇腺IMC中表达增加暗示IMC似乎逃脱凋亡，形成炎性浸润灶。
原发性干燥综合征（primarySjogren\"ssyn-drome，pSS）又称自身免疫性外分泌腺体病，是全身少坤、袁威玲）；青岛大学医学院附属医院风湿科（王吉波）慢性炎症性自身免疫病，以淋巴细胞浸润外分泌腺（如涎腺和泪腺）为特征，导致腺体功能失调。pSS病因、发病机制仍不十分清楚。近年来研究表明细胞凋亡是自身免疫性疾病发病的重要因素。我们采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）和免疫组织化学方法对甲醛固定及石蜡包埋的pSS患者及对照的唇腺组织进行细胞凋亡及相关基因表达的研究，旨在探讨pSS唇腺组织破坏的机制及由凋亡相关基因介导的细胞凋亡在pSS发病中的作用。
1资料与方法1.1临床资料选择30例经我院风湿科、眼科、口腔科及病理科2001年1月至2002年11月间确诊的pSS（按照2002年修订的干燥综合征国际分类标准患者的唇腺活检标本，每例均有详细的临床记录。术前均未接受激素及免疫抑制剂治疗。均为女性。年龄28~72岁，肀均50岁。对照组10例，女性7例，男性3例。
年龄33~61岁，肀均47岁。其中4例为下唇黏液腺囊肿，2例为下唇外伤，1例为下唇畸形患者标本。另外3例为有口干症状但唇腺病理正常、血清学阴性者标本，兔抗人Fas、FasL多抗及鼠抗人Bcl-2单抗由美国SantaCruz公司生产，原位细胞凋亡检测试剂盒由德国BoehringerMannheim公司生产。
1.2实验方法苏木素复染。阳性对照在滴加反应液前，置1gADNaseI溶液中室温孵育15min；阴性对照组仅加duTP-FITC（不加TdT酶溶液）。
1.3免疫组织化学染色及TUNEL法检测细胞凋亡结果判定Fas、FasL标记阳性物质主要定位于细胞的胞质和胞膜，Bcl-2标记阳性物质主要定位于细胞的胞质，阳性结果为棕黄色颗粒。TUNEL法染色细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。Fas、FasL和Bcl-2及凋亡细胞计数方法为每例随机选择5~7个高倍视野（400倍），计数每个视野中标记阳性的及凋亡的腺泡上皮细胞（AEC）、导管上皮细胞（DEC）、单核细胞（IMC）以及每类细胞的总数，计算每类阳性细胞数及每类细胞凋亡的细胞数占各类细胞总数的百分比，求其肀均值。
1.4统计学方法1.2.1免疫组织化学染色（SP法）：厚2！m唇腺石蜡切片脱蜡后至水，3H22室温孵育10min以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗后磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡5min，行抗原修复，PBS洗2minx3次，加5~10正常山羊血清工作液封闭、室温孵育15min，分别加1：50兔抗人Fas、FasL及鼠抗人Bcl-2抗体，4过夜，PBS冲洗5minx3次后滴加生物素标记的二抗工作液，放置于室温30min，PBS冲洗5minx3次，滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30min，PBS冲洗5minx3次，DAB显色，苏木素复染。阳性对照采用乳腺癌石蜡切片，阴性对照采用PBS替代抗体。
1.2.2细胞凋亡（TUNEL法）：石蜡切片脱蜡后至水，滴加胃蛋白酶消化液2A滴，置37温箱孵育11.5软件做统计学分析，实验数据用表示。计量资料组间比较采用独立样本检验或检验，两个变量相关分析用pearson相关分析，以<0.05为差异有显著性。
2结果TUNEL法凋亡细胞在唇腺组织中的表达：pSS组和对照组唇腺组织中均可见凋亡细胞，且以DEC明显，pSS组细胞凋亡高于对照组（见）。pSS组AEC、DEC细胞凋亡率与对照组比较差异有显著性（均<0.001）；pSS组IMC细胞凋亡率与对照组比较差异无显著性（>0.05），见表1. Fas蛋白在唇腺组织中的表达：pSS组和对照组唇腺组织均可见阳性表达，对照组部分唇腺组织不表达Fas（见图表1 pSS组与对照组唇腺组织细胞凋亡率及相关基因蛋白表达的比较（N）（！±\"）组别对照组组别凋亡率（N）对照组阳性表达细胞百分比与对照组比较差异均有显著性FasL蛋白在唇腺组织中的表达：FasL主要在pSS病人唇腺组织中表达，且以DEC表达为著；在DEC，Fa>L主要表达于导管腔表面（见）。对照组大多不表达或表达极弱。pSS组AEC、DEC、IMC的Fa>L阳性表达细胞百分比与对照组比较差异均有显Bcl-2蛋白在唇腺组织中的表达：Bcl-2在pSS组和对照组唇腺组织中均可见表达，以对照组上皮细胞和pSS组IMC表达强度高（见）。pSS组AEC\"DEC和IMC的Bcl-2阳性表达细胞百分比与对照组比较差异均有显著性（！<0.001、<0.05、< pSS唇腺组织AEC\"DEC及IMC中基因表达相关蛋白与细胞凋亡的相关性比较：AEC中，Fa>及Fa>L阳性表达细胞百分比与细胞凋亡率均呈正相<0.01），而Bcl-2阳性表达细胞百分比与细胞凋亡率无相关性（\"=-0.329，>0.05）；DEC中，Fas及FasL阳性表达细胞百分比与细胞凋亡率均呈正相关，Bcl-2阳性表达细胞百分比与细胞凋亡率呈负相！<0.05、<0.01、<0.05）；IMC中，Fas及FasL阳性表达细胞百分比与细胞凋亡率均呈正相关，Bcl-2阳性表达细胞百分比与细胞凋亡率呈负相关，相关系数有统计学意义（\"=0.804、0.489、-0.364，<0.01、3讨论近年来研究pSS（自身免疫外分泌腺体病）病人和动物模型，已发现疾病在两种成功的病理阶段进展：①起始阶段：在这个阶段AEC发生不适当的程序化死亡（PCD）；②淋巴细胞浸润和自身免疫攻击的后期阶段：在这个阶段进一步和进行性腺体损伤和功能丧失发生。阶段是淋巴细胞非依赖性的，可能被PCD调节异常或者上皮细胞增加对PCD敏感性导致。第二阶段是淋巴细胞依赖性的并与浸润腺体的淋巴细胞凋亡抑制有关，恰与腺泡上皮细胞凋亡对立）2*.pSS外分泌腺上皮细胞存在Fas.本研究显示pSS组唇腺AEC和DEC细胞凋亡率较对照组显著升高，提示细胞凋亡可能是pSS唇腺组织破坏功能失调的原因之一。pSS组AEC和DEC的Fas及FasL蛋白表达显著高于对照组，且与细胞凋亡率呈正相关，说明pSS患者唇腺组织上皮细胞（AEC和DEC）凋亡很可能是由Fas/FasL途径介导的，即Fas/FasL介导的细胞凋亡可能是pSS患者唇腺组织破坏的一个重要原因，结合本研究显示的pSS组上皮细胞及IMC的FasL显著高于对照组，提示腺上皮细胞的凋亡除来自腺上皮本身FasL介导外，还来自IMC的FasL介导，故pSS腺上皮凋亡可能被两种不同的方法解释：首先，上皮细胞可能被内在激活通过膜折叠Fas和FasL的自分泌相互作用杀死它们自己；其次，上皮细胞与IMC可能通过Fas/FasL途径相互作用而变得对Fas诱导的凋亡敏感。本研究还显示pSS组AEC及DEC的Bcl-2蛋白表达明显低于对照组，且DEC的Bcl-2蛋白表达与细胞凋亡率呈负相关，而AEC的Bcl-2蛋白表达与其细胞凋亡率虽无相关性，但相关系数为负值，提示pSS唇腺上皮细胞凋亡增加可能由Bcl-2表达减少所致，即Bcl-2表达减少亦可能为pSS唇腺组织破坏的原因之一。综合以上研究结果，pSS病人唇腺上皮细胞中凋亡诱导基因（Fas和FasL）的过度表达及凋亡抑制基因（Bcl-2）的表达减少，促进上皮细胞凋亡，进而导致腺体破坏、功能失调。
本研究结果显示，pSS组唇腺IMC细胞凋亡率与对照组比较差异无显著性，提示pSSIMC凋亡受阻。pSS组IMC的Fas及FasL蛋白表达显著高于对照组，且与细胞凋亡率呈正相关，Bcl-2蛋白表达亦明显高于对照组，但与细胞凋亡率呈负相关，提示IMC的细胞凋亡亦通过Fas/FasL介导，Bcl-2表达增加可导致IMC凋亡减少。综合以上研究结果，虽然pSSIMC的Fas/FasL蛋白表达上调，但由于同时Bcl-2蛋白表达亦上调，从而使pSSIMC逃脱凋亡，形成炎性细胞浸润灶，支持报道的研究。
另外，本研究还显示FasL蛋白在DEC主要表达于导管腔表面，与报道相符，可解释FasL的可能转移及pSS患者外周血sFasL水G显著增高。
综上所述，pSS患者唇腺组织上皮细胞凋亡的增加和IMC凋亡减少可能是导致腺体破坏及功能丧失原因之一；Fas、FasL表达增加及Bcl-2表达减少皆与促进凋亡有关；Bcl-2在pSS的IMC中表达增加暗示IMC似乎能逃脱凋亡，形成炎性浸润灶。
（本文~4见插页第9-1页）