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角膜片的制作选用质量为2～3kg的家兔，空气心梗处死后立即摘除眼球，沿距角膜2mm处，剪下带有巩膜边的角膜，巩膜剪的一定要圆，这样可以减少角膜褶皱的产生，预留2mm巩膜对角膜起到了支撑作用，利于保持角膜的形状，便于冷平衡及梯度降温过程中角膜片的夹取，减小对角膜内皮细胞的机械损伤。
配制保护液。保护液的成分和浓度对冻干角膜内皮细胞的成活率影响很大，需要严格控制。角膜冷平衡制作好的角膜片放入保护液中，在4℃的温度下进行四步法冷平衡，目的使渗透性保护剂二甲基亚砜（DMSO）置换出角膜细胞内部分水分，以防止梯度降温时水结冰，体积膨胀，损伤角膜细胞。
具体操作过程：将制作好的角膜片用不同的保护液处理，即将无菌的角膜片先放入1号液，移入4℃冰箱冷平衡10min，然后用无菌镊子夹住巩膜边，将其移入2号液平衡10min，依次在3号液、4号液中各平衡10min。梯度降温梯度降温在自制简易降温仪中进行。采用两步法速率降温，**步角膜距液氮面9cm，角膜内部温度稳定在-16～-20℃范围内，此阶段角膜的降温速率为2～2.4℃/min；第二步角膜距液氮面1.5cm，角膜内部温度稳定在-130～-150℃范围内，此阶段角膜的降温速率为10～12℃/min。1.5干燥角膜的真空冷冻干燥是在东北大学研制的ZLG-0.05型真空冷冻干燥机中进行的。
