铁皮石斛类原球茎空气干燥法超低温保存中的脱水蛋白分析

铁皮石斛类原球茎空气干燥法超低温保存中的脱水蛋白分析林伟强边红武王君晖*朱元（浙江大学生命科学学院，杭州310012）铁皮石斛类原球茎脱水时间（x）对含水量（y）的回归方程式为y=1208x+9.9636.含水量下降为G1~0.5g/gDM时，冻后存活率达到大值。当含水量达1. 0g/gDM时，热稳定蛋白的含量明显增加，经免疫检测其中分子量分别为287和34.3kD的两个热稳定蛋白为脱水蛋白。认为含水量是铁皮石斛超低温保存成功的关键因素，也是引起脱水蛋白大量积累的重要条件。
超低温保存的基本策略是通过降低细胞含水量来避免胞内冰晶的损伤。空气干燥法无需冻前和冻后复杂的处理，是避免细胞内结冰的有效途径。近年来，空气干燥法常用于保存茎段、体细胞胚或合子胚等，本实验室用该法己成功地冻存了水稻悬浮细胞和铁皮石斛的种子及初生原球茎。大量试验证明植物细胞如果能耐受超低温保存前的脱水处理，就能在快速冷冻过程中存活。
因此在超低温保存中，植物细胞抗脱水性的研究显得十分重要。
在脱水胁迫下，植物细胞发生了一系列的代谢变化和细胞生物学变化。许多研究发现，可溶性糖和热稳定蛋白的积累在植物维持正常细胞功能和耐脱水胁迫方面具有重要作用。其中LEAI-族基金项目：国家自然科学基金项目（399012）即脱水蛋白是研究较为深入的一类蛋白，它富含极性氨基酸，具有高度亲水性和热稳定性，能在高温下保持分子构像不变。脱水蛋白都具有一个或几个两亲性的a-螺旋区（K区），这个区域在高等、低等植物的脱水蛋白中都是高度保守的，为15个残基的共有序列（EKKGIMDKIKEKLPG），以这段保守残基来制备单抗，可用于检测植物脱水蛋白。目前，许多研究者认为脱水蛋白的积累与植物细胞抗冻、抗脱水力的形成有密切关系，并推测脱水蛋白的作用机理可能有3方面：1，稳定膜系统；2，作为冰冻保护剂；3，抑制大分子的团聚M.铁皮石斛为我国名贵珍稀中药材，将脱水蛋白的知识运用于铁皮石斛类原球茎的超低温保存，为种质资源保存提供新的研究内容。在近十几年内，国外脱水蛋白的研究十分活跃，国内傅家瑞教授等在种子脱水蛋白方面做了许多工作。目前对兰科植物的脱水蛋白研究很少。
1材料与方法1.1材料脂（0.8）固化的1/2MS培养基上（光照2000lx，温度25*C*1*C）培养，每两周继代1次。取继代后1周的类原球茎进行超低温保存试验。
1.2方法1细胞脱水和超低温保存将0.6g左右的铁皮石斛类原球茎样品放入50mL三角瓶中，封上透气封口膜（北京振泰园艺设施公司），放入AI-126电子干燥箱（台湾防潮科技股份有限公司）中脱水（相对湿度25±5，25*C*1*C，光照2000lx）。当样品脱水至一定含水量时，取一半的样品放到冷冻管投入液氮中；而另一半样品用来恢复培养，计算冻前存活率。
1.2.2含水量和存活率的测定称取铁皮石斛类原球茎记为鲜样质量（FM），样品在80°C烘箱里烘48h获得干样质量（EM）。在干燥过程中，通过阶段性称量样品来计算含水量，重复3次。含水量的冻前的样品和复温后的样品先接种在琼脂（0. 8）固化的含20可溶性淀粉的1/2MS培养基上，2d后转移到正常的1/2MS固体培养基上，培养条件均为25*C*1*C，暗培养。恢复生长率是指恢复培养4周后样品（干样质量）的长百分率。重复3次。
1.2.3热稳定蛋白的提取取0. 6g左右的样品，在液氮中研磨成粉状，置于2mLEppendorf管中，然后加入1mL样品提取液〔50mmol/LT-HCl（pH8-0），1mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl，100/mLPMSF〕，充分摇匀，6726g离心10min，将上清移入新的EppendoIf管，于larC水浴10min，冰浴至室温，6726g离心5min，将上清液以每管300UL分装，加入4倍体积预冷的丙酮，摇匀后于-20*C静置30min，再以5381g离心5min，去上清液获蛋白质沉淀，用80丙酮洗潘沉淀1次，敞开管口，使残余的丙酮完全挥发。将沉淀溶于40UL样品提取液（不含PMSF），于-20*C冰箱中保存4SDSPAGE及脱水蛋白的Westen-Blot检测热稳定蛋白在Min-PROTEANIllcell（BioRad公司生产）电泳。浓缩胶浓度为4，分离胶浓度为12.每加样孔蛋白质上样量约为20作，上样前将一定量的样品与等体积2倍SDS凝胶上样缓冲液〔1⑴mmol/LTni-HCl（pH6.8），200mmol/LDTT，4SDS，0.2溴酚蓝，20甘油〕相混合。电泳后，凝胶用考马斯亮蓝1-250进行染色。
（德国Roche公司产品）上。脱水蛋白抗体（1：1000稀释）由美国加州大学的TimothyJ.Close教授赠送。用于蛋白质免疫检测的试剂盒购自晶美生物工程公司，为美园艺学报31卷2结果2.1铁皮石斛类原球茎的脱水处理在正常继代条件下，铁皮石斛类原球茎的含水量为10.4g/gDM，占鲜样质量的91. 2.为本试验体系中脱水时间与铁皮石斛类原球茎含水量的关系。随着脱水时间的延长，细胞含水量降低。
A的含水量是以g/gDM来表示的，回归方程式为y= 9.9636，其中x为脱水时间，而y为相对应的含水量，含水量变化呈线性关系，斜率为含水量下降速率，即每小时减少0.1208g/gDM.在相同条件的脱水试验中，可根据该含水量下降速率较地预测脱水时间与细胞含水量的关系，减少称量次数，从而保持干燥箱湿度的恒定，便于试验操作。B的含水量是以鲜样质量为分母来表示的，含水量变化呈曲线，在脱水0~50h内含水量变化不大，较难根据脱水时间准确预测含水量的变化。因此本试验样品的含水量均以g/gDM来表示。
铁皮石斛类原球茎的含水量随着脱水时间的下降过程表1含水量对铁皮石斛类原球茎恢复生长率（培养4周后干样质量长倍数）的影响起始干样品含水量脱水后（冻前）恢复冻后恢复生长率生长率土SE士SE 2.2细胞冻前含水量对超低温保存的存活率影响表1为不同含水量的铁皮石斛类原球茎在冻前和冻后的存活率（恢复生长率）。随着含水量降低，铁皮石斛类原球茎的冻前存活率也随着降低。
含水量为0.1g/gDM的样品冻前存活率显著低于的细胞（P<的含水量对样品产生明显的脱水损伤。然而经过液氮保存后，含水量大于或等于1.0g/gDM的样品不能存活。含水量为0.1g/gDM的样品冻后存此，对于铁皮石斛类原球茎而言，超低温保存的适含水量在0.1~0.5g/gDM之间。
2.3含水量对热稳定蛋白和脱水蛋白积累的影响A是经考马斯亮蓝1-250染色的热稳定蛋白SEEPAGE的结果。未脱水样品热稳定蛋白主要有两条条带，分子量分别为28.7、19.2kD.当含水量减少到1.0g/gDM时，热稳定蛋白大量积累，可清楚看到明显的5条条带，分子量分别为34. 3kD.随着含水量的进一步降低，没有观察到新的明显的条带出现，而且热稳定蛋白在量上并没有加。经过脱水蛋白的WesternBlot检测，发现只有当含水量等于或低于1. 0g/gDM时，铁皮石斛类原球茎的热稳定蛋白中有两条为脱水蛋白，它们的分子量分别为34.3和28.7kD（B）。可见在含水量下降速率为0. 1208g/gDM时，铁皮石斛类原球茎热稳定蛋白和脱水蛋白大量积累的关键含水量为1.0g/gDM.铁皮石斛类原球茎的热稳定蛋白分析（SD-PAGE检测，A）和脱水蛋白分析（WesternBlot检测，B）每一孔道样品的含水量从左到右分别是10.4（对照，01），3.0，20，1.Q0.5，0.1g/gDM. 3讨论冻前植物样品含水量的控制是超低温保存成功的关键因素。如果样品脱水不充分时，就会因胞内冰晶的形成而导致冰冻损伤；相反，如果样品脱水过度，则形成渗透胁迫的损伤。当含水量为0.1g/gDM时，样品冻前存活率和冻后存活率差异不显著（P> 0.05），这说明了0.1g/gDM含水量的样品在超低温保存中的损害主要由脱水形成的，而液氮冻存没有对样品造成损伤。由此可见，只要铁皮石斛类原球茎能耐受如此严重的脱水，那么，也就能避免了胞内结冰并实现成功的超低温保存。因此，植物细胞的抗脱水能力是空气干燥法超低温保存的关键。对于铁皮石斛类原球茎空气干燥法超低温保存而言，样品适的冻前含水量为0.1~0.5g/gDM.脱水蛋白是种子成熟脱水过程中或植物在脱水和低温等胁迫条件下，被高水平诱导表达，是目前研究较多的一类与脱水胁迫相关的逆境蛋白质。本试验发现只有当含水量低于1.0g/gDM时，脱水蛋白大量积累。在不同植物中，脱水蛋白开始被诱导合成的含水量各不相同。如北美野生稻（Zzaniapa*）幼苗在含水量为3. 0g/gDM时脱水蛋白就开始表达。不同种类之间差别的原因尚不清楚，但有一点是明确的，在脱水胁迫下，含水量的降低是诱导脱水蛋白表达的关键因素。
大量试验发现脱水蛋白与植物细胞抗冻抗脱水力有一定的联系。本试验表明在铁皮石斛类原球茎受到严重脱水时，脱水蛋白大量积累。因此推测脱水蛋白对细胞耐受脱水胁迫可能起到保护作用。也有研究认为仅有脱水蛋白存在并不能有效起到抗脱水抗冻作用。早有报道，糖类对蛋白质的保护作用与抗冻有关。Walters等发现从小麦胚提取出的脱水蛋白与糖类物质紧密的结合在一起，且这一复合物相对于普通蛋白与糖类物质的混合物来说，具有更高的水结合能力。因此，脱水蛋白可能与糖类物质或其它渗透物质相互作用发挥更大的抗冻、抗脱水力。为了确切了解植物脱水蛋白在超低温保存过程中的作用，还需进行更深入的研究。