水通道蛋白在干燥综合征患者唇腺中表达的实验研究

干燥综合征（ss）患者涎腺活检显示淋巴细胞的浸润使腺泡数量大约减少了50，除了腺体的器质性损害之外，腺体功能障碍也是导致口干的重要原因，包括致炎因子的作用：如IL-1和TNF-a能阻碍腺体分泌唾液，通常涎腺的腺泡细胞分泌等渗液体，而导管细胞拥有Na+通道和CL-通道以及钠离子泵，参与盐分的重吸收。近年来陆续发现的水通道蛋白（waterchannelprotein，AQP）与Na+和CL通道以及钠离子泵作用相似，这些水通道蛋白具有快速和选择性促进水的穿膜运动，达到渗透梯度的作用。迄今至少己发现了10种水通道蛋白亚型，其中己证实AQP1和同组织结构中起重要作用。本实验拟将SS患者唇腺组织进行免疫组化定位和Westernblot定量分析，研究AQP1和AQP5在SS患者唇腺中的表达特点，初步探讨AQP1、APQ5在涎腺分泌中的机制，为SS的基因治疗提供理论依据。
材料与方法1.材料1.1主要试剂SP-9003免疫组织####盒，DAB显色试剂盒，生物素化兔抗山羊IgG，辣根酶标记链亲合素，牛血清白蛋白粉剂（北京中山生物技术有限公司）。Tripure蛋白提取试剂盒，抗AQP1抗体，抗AQP5抗体，中分子量标准蛋AQP59与A类涎腺唾液分泌；密切相在涎Mishin白质Sn狱Rad凝胶成像仪，Bi（o-Rad半干转膜仪（美国Sigma公司）。
2.1组织取材与分组将病理及临床诊断为干燥综合征且淋巴细胞浸润达一个灶以上的女性患者唇腺标本10例作为实验组，在给口腔颌面外伤的女性患者清创时，征得患者同意后摘除其正常唇腺组织标本（10例）作为对照组。每例唇腺标本一部分用于冰冻切片作免疫组化检测，一部分置于-70°C冰箱中备用作组织总蛋白的提取。
2.2免疫组化检测（SP法）取出冰冻切片，0.1 2次；置于0.3甲醇过氧化氢溶液，室温孵育20min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，加封闭血清1hi；加一抗（AQPi、AQP5抗体稀释度分别为1：100和1：200），37°C孵育1h；PBS洗5minx3，加生物素化兔抗山羊IgG，37°C孵育1h；PBS洗5minx3次，加辣根酶标记链霉卵白素，37°C孵育1h；PBS洗5minx3，DAB显色、冲洗、封片。染色结果判定：组织出现明确棕黄或棕褐色颗粒判定为阳性。
°C冰箱中的标本，称取各组标本100mg，分别置于5ml离心管中，各加入1mlTripure裂解液（按照Tripure试剂说明书进行），转移上清置于-20°C冰箱中备用。
制定标准曲线将中分子量标准蛋白稀释为以下6个200ul，紫外可见分光光度计测吸光度。以蛋白标准浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标作曲线。
测样本浓度：将提取的蛋白溶液25ul稀释8倍200ul，按①的步骤进行测量，得到相应的吸光度值。将待测标本吸光度值在标准曲线上查出其对应的浓度，乘以适当稀释倍数即为样本浓度。
2.3.2免疫印迹取样本提取液各15ul，分别加上样缓冲液15ul混合，取标准蛋白加200ul上样缓冲液，一起煮沸5min；加样（提取液加入总蛋白30ug，标准蛋白5ug），缓冲液封闭，电泳板装槽，电泳电压稳定在60 PAGE电泳5h；取电泳完毕的胶进行转膜：滤纸置于电转液中浸透，将5张滤纸置于半干转膜上，放置浸透的PVDF膜、凝胶、5张滤纸；15V电压转膜40min；转膜后将PVDF膜置于1 BSA中封闭4°C冰箱中过夜；倒出1BSA后，直接加一抗（AQP1、APQ5稀释度均为1：1000）置于37°C中1h；PBST洗涤5minx3次，加生物素化兔抗羊IgG3ug/ml37°C摇床1h；PBST洗涤5minx3次，加辣根素标记链亲合素3ug/ml37°C摇床1h；PB~ST洗涤5minx3次，DAB显色，扫描并照相。用四川大学图像分析软件对扫描结果进行分析，得到平均吸光度值（A）。
3.统计分析采用SPSS11.0软件对数据进行统计分析，采用团体比较t检验，以P<0.05和P<0.01分别表示相差显著和非常显著。
结果的一抗浓度时可以看到它们在唇腺有稳定、清晰的染色：AQP1分布在腺泡的基底膜、毛细血管内皮细胞及导管基底膜等处；AQP5主要分布于腺泡细胞的顶膜、侧膜和导管等处；SS组表达减弱，但残存的腺泡部位，AQP5与腺泡细胞的顶膜表达减少，而基侧膜的表达增强；AQP1和AQP5表达在腺泡部位均减弱，主要分布在导管部位。见-4. Lowry‘s法检测提取的蛋白浓度蛋白标准浓度吸光度值标准曲线2.1.2标准曲线回归方程的回归分析应用曲线估计法对蛋白浓度和吸光度值的相关关系进行回归拟合用SPSS11.0软件分析，得到回归方程式：Y=0.0071+0.002X. 2.1.3样本蛋白质浓度（g/L）样本蛋白质浓度用x士s表示，各组样本蛋白质浓度均数之间进行方差分析检验P>0.05，说明各组数据之间没有显著性差异，见表1. 2.2蛋白印迹结果各组样本中均可检测到AQP1和AQP5的表达：分别出现分子量为28kD、27kD的条带。组织总蛋白Westernblot分析结果显示，SS组显著降低（P< 3，图表1用Tripure裂解液提取的蛋白浓度样本编号x土s对照组SS组表2 Westernblot检测AQP|蛋白表达量样本编号：与对照组比较P<0.01表3 W’esternblot检测AQP5蛋白表达量么曰别丨-样本编号均粉正常人唇腺组织AQP，的表达，分布在SS患者唇腺组织AQP，的表达，主要分正常人唇腺组织AQP5的表达，主要分腺泡的基底膜、毛细血管及导管基底膜等处。免疫组化SP200布在毛细血管及导管基底膜等处。
免疫组化SP400布于腺泡细胞的顶膜、侧膜和导管等处。免疫组化SP400 SS患者唇腺组织AQP5的表达，主要分1、2：SS组；3、4：对照组a、b：SS组；c、d对照组布在腺泡细胞的基底膜，顶膜减少或消Westernblot分析AQP|的表达WZesterblot分析AQP5的表达失，导管表达增强。免疫组化SP400早在十几年前人们对水通道蛋白就有所认识，但在水转运中的具体作用，尤其在唾液分泌过程中的认识，只是在近年来才得以发现。在哺乳动物内，迄今至少己发现了10种水通道蛋白亚型（从AQP0到AQP9）。AQP的分布具有组织和细胞特异性，参与人体内多种生理功能的调节，对维持人体正常生理状态具有重要作用，其中AQP，和AQP5被证实与唾液的分泌密切相关15‘6. blot均出现一28kD的条带，与AQPi的分子量相符。与对照组比较，AQP，的表达量显著减少（P< 0.01），但免疫组化染色可见残存腺泡和导管上皮细胞基底膜的AQP，表达较丰富。
水通道蛋白家族中早被确定分布在涎腺腺泡细胞的是AQP5，分布于腺泡腔的顶膜、侧膜、闰管和导管上皮细胞中，AQP5构成涎腺唾液分泌的通道，它与其它亚型一样具有水转运的特性，而且与AQP2相似，在细胞内襻中有蛋白激酶A（PKA）介导的磷酸化作用使AQP5产生快速的“闸门”效应。此外，AQP5还本实验免疫组化结果证实AQP，不仅限于毛细血表达于肺泡I型细胞、泪腺腺泡，分别与肺脏渗出液和管管和腺泡部位也有清晰的抗体标记。Wmishhf液的分泌密切相关lsMa等；：进一步研究发现敲除AQP5基因后的大鼠，经毛果芸香碱刺激其唾液分泌量减少了60以上，推测AQP5在唾液分泌中起着重要作用。本实验免疫组化显示SS组AQP5表达有非常显著改变：即AQP5在腺泡上皮细胞顶膜表达减少或消失，而基侧膜的表达强，这种表达部位的/易向0可能是水通道蛋白将水分从腺泡细胞顶膜向基侧膜逆向转运，加重了唾液分泌的减少；但是，残存的导管上皮细胞仍然有较强的表达，可能是导管上皮细胞部分改变了其原本单纯重吸收的功能，也参与了水分的分泌，其机制尚需进一步研究。Towne等19研究了小鼠急性肺部腺病毒感染后7- 14d肺组织中AQP，和AQP5在mRNA和蛋白水平上的表达显著减少，而作为对照的Na-K三磷酸腺苷a表达水平无显著改变，推测可能由于病毒感染导致炎症因子阻碍了AQP，和AQP5的表达，引起肺水肿。与此相似，本实验Westemblot结果发现SS唇腺中AQPi和AQP5的蛋白表达量均显著降低（P<0.01）。我们认为可能由于受多种因素作用导致AQPi和AQP5表达严重不足，从而引起唾液分泌量的减少。涎腺上皮细胞中AQPi和AQP5构成了涎腺分泌的水分子通道，对调节水分转运速率，维持唾液的分泌起了重要作用。当SS致涎腺的严重破坏时，AQPi和AQP5的表达量都显著地减少，导致水分转运失代偿，因此利用转基因技术有望将残存的导管上皮细胞转变为能分泌水分及盐分的腺泡样细胞，即改变细胞类型的基本功能，从而改善口干症状，为SS的基因治疗提供了一个新的思路和依据。
2|杨军，肖林，孙远，等。人涎腺水通道蛋白的定位|J|.第三军医大学学报，2002，24（8）：纹唇术后严重过敏反应10例报告刘英（川北医学院附属医院口腔科四川南充637000）美容；纹唇术；变态反应本组10例均为女性，年龄18-36岁。因唇红肿、水疱、糜烂，结痂伴疼痛而来我院就诊，其中3例己形成瘢痕，质地较硬，唇红处密布粟粒状丘疹或脱皮。均因在美容院行纹唇术（纹唇液品名、成分不详），术后上下唇出现密集水疱、大小不一，疱破后形成糜烂面，同时伴有发红痒痛，自服消炎抗菌药无效来我院就诊。检查见：上下唇红肿糜烂，有渗出或结痂，其中3例纹唇术后时间较长者可见唇肿胀，质硬，唇红散布密集粟粒状丘疹或有鳞屑覆盖。10例均诊断为：过敏性唇炎（纹唇术引起）。
治疗方法：抗过敏治疗并辅以抗感染治疗。口服息斯敏9 mg/d，维生素C d；阿莫西林胶囊0.5g，3次/d.局部治疗以清洁、消炎、收敛为主。有痂皮者用生理盐水浸泡，使痂皮软化，然后剥脱，再用0.2洗必泰湿敷20 min，后用四环素可的松软膏（或红霉素）软膏局部涂擦，3次/d.对于病变较久己形成瘢痕者可用激素类混悬液行唇周封闭治疗，软化瘢痕。
疗效：就诊及时，病情轻者，用药后3d明显好转，1周后基本恢复正常；病程长，有瘢痕形成者，治疗显效较慢，但自觉症状减轻或消失，瘢痕变软，变薄，唇红外形恢复。